醋酸纤维素薄膜作用电泳的支持物有何优缺点

醋酸纤维素薄膜作用电泳的支持物有何优缺点
醋酸纤维素薄膜作用电泳的支持物有何优缺点

醋酸纤维素薄膜作用电泳的支持物有何优缺点
醋酸纤维素薄膜电泳的特点：
醋酸纤维素薄膜是由醋酸纤维素加工制成的.醋酸纤维素薄膜作为是电泳支持体.
它有以下优点：
①电泳后区带界限清晰；
②通电时间较短（二十分钟至一小时）；
③它对各种蛋白质（包括血清白蛋白,溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附,因此无拖尾现象；
④对染料也没有吸附,因此不结合的染料能完全洗掉,无样品处几乎完全无色.它的电渗作用虽高但很均一,不影响样品的分离效果,由于醋酸纤维素薄膜吸水量较低,因此必需在密闭的容器中进行电泳,并使用较低有电流避免蒸发.
醋酸纤维素薄膜电泳已经广泛用于血清蛋白,血红蛋白,球蛋白,脂蛋白,糖蛋 白,甲胎蛋白,类固醇及同工酶等的分离分析中,尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低,但它具有简单,快速等优点.根据样品理化性质,从提高电泳速度和分辨力出发选择缓冲液的种类,pH和离子强度.选择好的缓冲液最好是挥发性强,对显色或紫外光等观察区带没有影响,若样品含盐量较高时,宜采用含盐缓冲液.例如血清蛋白电泳可选用pH8.6的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲液；氨基酸的分离则可选用pH7.2的磷酸盐缓冲液等.电泳时先将滤膜剪成一定长度和宽度的纸条.在欲点样的位置用铅笔做上记号,点上样品,在一定的电压,电流下电泳一定时间,取下滤膜,进行染色.不同物质需采用不同的显色方法,如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位,但许多物质必须经染色剂显色.
醋酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下,溶于一定的溶剂中进行光密度测定.也可以浸于折射率为1.474的油中或其他透明液中使之透明,然后直接用光密度计测定.
它的缺点是厚度小,样品用量很小,不适于制备.
原理：
醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate membrance electrophoresis）以醋酸纤维薄膜为支持物.它是纤维素的醋酸酯,由纤维素的羟基经乙酰化而制成.它溶于丙酮等有机溶液中,即可涂布成均一细密的微孔薄膜,厚度以0.1mm—0.15mm为宜.太厚吸水性差,分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎.
醋酸纤维素薄膜与滤纸相比较,有以下优点
（1）醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少,无“拖尾”现象,染色后背景能完全脱色,各种蛋白质染色带分离清晰,因而提高了测定的精确性.
（2）快速省时.由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小,薄膜中所容纳的缓冲液也较少,电渗作用小,电泳时大部分电流是由样品传导的,所以分离速度快,电泳时间短,一般电泳45—60min即可,加上染色,脱色,整个电泳完成仅需90min左右.
（3）灵敏度高,样品用量少. 血清蛋白仅需2μl血清,甚至加样体积少至0.1μl,仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离带.临床医学检验利用这一点,检测在病理情况下微量异常蛋白的改变.
（4）应用面广.某些蛋白在纸上电泳不易分离,如胎儿甲种球蛋白,溶菌酶,胰岛素,组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离.
（5）醋酸纤维素薄膜电泳染色后,经冰乙酸,乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板,有利于扫描定量及长期保存.
2、醋酸纤维素薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比,操作简单,但分离效果不太好.如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中,只能分离出5—6条区带,而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数10条区带.
[应用意义]
由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、廉价.目前已广泛用于检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子,为心血管疾病,肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据,因而成为医学和临床检验的常规技术.
[注意事项]
1、醋酸纤维素薄膜的预处理
市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片,薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一.将干膜片漂浮于电极缓冲液表面,其目的是选择膜片厚薄及均匀度,如漂浮15s—30s时,膜片吸水不均匀,则有白斑点或条纹,这提示膜片厚薄不匀,应舍去不用,以免造成电泳后区带扭曲,界线不清,背景脱色困难,结果难以重复.由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小,浸泡30min以上是保证膜片上有一定量的缓冲液,并使其恢复到原来多孔的网状结构.最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉,这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走.点样时,应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去,以免缓冲液太多引起样品扩散.但也不能吸得太干,太干则样品不易进入薄膜的网孔内,而造成电泳起始点参差不齐,影响分离效果.吸水量以不干不湿为宜.为防止指纹感染,取膜时,应戴指套或用镊子.
2、缓冲液的选择
醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥溶液,其浓度为0.05mol/L—0.09mol/L.选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关.选择时,先初步定下某一浓度,如电泳槽两极之间的膜长度为8 cm—10cm,则需电压25V/cm膜长,电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm膜宽.当电泳达不到或超过这个值时,则应增加缓冲液浓度或进行稀释.缓冲液浓度过低,则区带泳动速度快,并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高,则区带泳动速度慢,区带分布过于集中不易分辨.
3、加样量
加样品的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关.作为一般原则,检测方法越灵敏,加样量则越少,对分离更有利.如加样量过大,则电泳后区带分离不清楚,甚至互相干扰,染色也较费时.如电泳后用洗脱法定量时,每厘米加样线上需加样品0.1μl—0.5μl约相当于5μg—1000μg蛋白.血清蛋白常规电泳分离时,每厘米加样线加样量不超过1μl,相当于60μg—80μg的蛋白质.但糖蛋白和脂蛋白电泳时,加样量则应多些.对每种样品加样量均应先作预实验加以选择.
点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一,以印章法加样时,动作应轻、稳,用力不能太重,以免将薄膜弄坏或印出凹陷而影响电泳区带分离效果.
4、电量的选择
电泳过程应选择合适的电流强度,一般电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm宽膜为宜.电流强度高,尤其在温度较高的环境中,可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发,使缓冲液浓度增加,造成膜片干涸.电流过低,则样品泳动速度慢且易扩散.
5、染色液的选择
对醋酸纤维素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择.其原则是染料对被分离样品有较强的着色力,背景易脱色；应尽量采用水溶性染料,不宜选择醇溶性染料,以免引起醋酸纤维素膜溶解.
应控制染色时间.时间长,薄膜底色深不易脱去；时间短,着色浅不宜区分,或造成条带染色不均,必要时可进行复染.
6、透明及保存
透明液应临用前配制,以免冰乙酸及乙醇挥发影响透明效果.这些试剂最好选用分析纯.透明前,薄膜应完全干燥.透明时间应掌握好,如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解,太短则透明度不佳.
透明后的薄膜完全干燥后才浸入石蜡中,使薄膜软化.如有水,则液体石蜡不易浸入,薄膜不易平展.