免疫组织化学染色过程中需要通透吗?为什么?

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免疫组化染色过程中对切片有哪些要求?
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匿名提问 2012-11-28
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回答者：匿名用户 时间:2012-11-28
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切片必须完整、均匀、平展、无邹折、
应用于免疫组织化学染色的切片,对切片的质量要求较高,切片必须完整,平展、无汽泡,无邹折,这样有利在染色时的冲洗,有利于切片的牢固附贴.如果切片不平展,免疫组化染色后,可出现染色不均匀的现象,颜色深浅不一,　不平.如果切片有汽泡切片在烘烤时,由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织,在其周围可观察到深浅不一的染色.如果切片有邹折,免疫组化染色后,在邹折的地方有深浅不一的颜色,这是一种假阳性,容易引走混淆.
切片的附贴必须牢固,必须使用合适的粘贴剂.
免疫组织化学染色前的前期准备工作,就是必须对新的载玻片进行处理,新的载玻片表面看起来很干净,有人认为不需要进行任何的处理,都能够适合使用,这是一种错误的想法.新出厂的载玻片,表面复盖着开一层油脂样的物质,如果不加以处理,对切片的附贴是极为不利的.我们的做法是：新的载玻片,放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜,然后取出,经自来水彻底冲洗后,浸入酒精中达2小时以上,取出擦干备用或烘干也可.然后再将载玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟,后经无水乙醇洗2次,烘干即可使用.
切片必须烘烤附贴牢固,既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片,又不至于破坏抗原.
应用于免疫组化染色的切片.由于整个过程需经几个阶段的处理,如抗原修复时抗原修复液的沸腾且需持续十几分钟,PBS的反复冲洗,有的甚至于4℃冰箱中孵育达十几小时.因此,对切片的质量要求很高,尤其是切片的附贴程度.以往有人主张切片在60℃以下烘烤30-60分钟即可按此进行结果是切片掉片严重,切片松动率占100%.切片究竟烘烤多长时间才合适,既不脱片和适合各项要求,又不至于破坏抗原.几组实验［］诊断P173认为,切片在60℃的恒温干燥箱中烘烤2-5小时最为合适.这是因为：抗原可耐受如此的温度,病理科一般使用的石蜡,其熔点在60℃左右,组织浸蜡时,浸蜡箱中的温度,一般都调在65℃左右,组织在这样温度中要浸泡2小时以上,才能达到彻底地浸蜡.组织中的抗原已经受了65℃的温度考验,保存下来的抗原,都已具有耐热性.另外,经上述时间烘烤出来的切片,附贴牢固,抗原保存好,染色成功率达100%,保证了病理诊断的及时性和准确性.
特需要注意的是,不管是应用于诊断的切片还是研究用的切片,烘烤后应尽快进行染色.如果切片切完后,迟迟不进行染色,存放于室温中或工作冰箱中,切片中的抗原将会随着时间的延长而逐渐消失,甚至出现假阴性.原则上是新鲜切片,即行染色,染多少张切多少张,这样才能尽可能的保存表达更多的抗原.
切片脱蜡必须干净,否则将会影响免疫组化染色的最后结果.
蜡不溶于水,不与其它的临床使用的抗体相融合.它只能靠特用的试剂,处理足够的时间,才能将其除去.如果脱蜡不干净,少许蜡存留于切片上,将会引起许多弊病,如染色不均匀,阳性物时隐时现,真假难辨,背景染色增加等.为了解决上述的问题,切片在染色前必须彻底脱蜡,目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯,因它脱蜡力强,脱蜡时间较短.较受使用者的青睐.脱蜡的时间要根据季节,室温和试剂的新鲜谋面是在不同.如果在夏天,室温较高,脱蜡试剂也新鲜,则脱蜡时间不需很多,3-5分钟就已足够.如果在冬天,室温较低,脱蜡试剂也较陈旧,则脱蜡时间需要延长,10-20分钟或更长.总之,操作时应根据不同的季节,不同的室温,不同的试剂来决定,脱蜡的时间,原则上是要彻底,干净,完全地脱去切片上的蜡.为了做到这一步,切片在脱蜡前的加温将有助于完成上述的要求.比如：当天切的切片,烧烤2小时后进行染色,切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程,如果预先切好烤好的切片,在染色前,还必须对切片进行加温10-20分钟,然后再行脱蜡,这样脱蜡速度加快,效果魁伟更好